七星彩

             技术服务
手机:18140203169
地址:成都市锦江区静安路1号98-1-116号

详细内容 你的位置: 首页 > 技术服务 > 技术服务  

IFA和IPMA方法测定猪瘟兔化弱毒病毒含量


来源:       发布时间:2014/9/1 0:00:00     点击率:560

IFAIPMA方法测定猪瘟兔化弱毒病毒含量

李晶梅,谢红玲

(武汉中博生物股份有限公司,武汉 430070

摘要:本研究使用间接免疫荧光方法(IFA)和过氧化物酶单层试验(IPMA)测定猪瘟兔化弱毒的病毒含量(TCID50)。两种方法都使用韩国JBT公司猪瘟单抗作为一抗,此单抗的稀释倍数最高为300倍。Trueblue过氧化物酶底物显色的、感染猪瘟兔化弱毒的阳性细胞呈现蓝色易于辨识,所以确定TrueblueIPMA方法中的酶作用底物。建立的的IFAIPMA方法与兔体反应热法进行了比较,证明两者存在一定平行关系,但IFAIPMA比兔体反应热法检测结果的数值低1个数量级左右。基于以上结果,TCID50方法可作为猪瘟疫苗效力检验的候选方法。

关键词:猪瘟兔化弱毒;TCID50IPMAIFA

猪瘟病毒(CSFVC株,又名猪瘟兔化弱毒株(HCLV),由其制备的猪瘟兔化弱毒活疫苗是广泛使用的主流猪瘟疫苗。兔体感染量(RID)和猪体半数保护量(PD50)是评价疫苗效力的指标。动物的饲养状况、健康状况等个体差异也会对检验结果产生影响。TCID50是病毒含量的测定方法之一,病毒在细胞内繁殖引起细胞病变(CPE),通过CPE的判定,计算病毒含量。CSFV不引起CPE,所以CSFV 病毒含量测定要结合免疫荧光方法(FA)、间接免疫荧光方法(IFA)或过氧化物酶单层试验(IPMA)等免疫学方法进行判定。

结合IFAIPMA的CSFV  TCID50的效价测定方法见于很多报道[1-3]。由于各文献并未对方法中的操作进行标准化,所以在实际应用中各反应条件均需逐一优化。本研究参考前人方法、结合自身经验、优化反应条件,建立了结合IFAIPMA的HCLV  TCID50的效价测定方法。方法使用的细胞为易于培养的ST传代细胞;猪瘟抗体选择的是可以商品化购得的猪瘟单抗;筛选的过氧化物酶底物TrueBlue的显色效果优于DABAEC。现将方法和条件优化过程整理如下。

1  材料和方法

1.1  材料

1.1.1  细胞和毒种    ST细胞、猪瘟兔化弱毒株、猪瘟半成品疫苗和猪瘟成品疫苗(细胞源,犊牛睾丸细胞)由本公司保存。

1.1.2  主要试剂    猪瘟单抗为韩国JBT公司产品,MEM培养基为Gibco公司产品,新生牛血清(NBS)为金源康公司产品,羊抗鼠IgG-FITCThermo公司产品,HRP-SPASigma公司产品,TrueBlue 过氧化物酶底物为KPL公司产品,AECDAB过氧化物酶底物为武汉博士德公司产品,细胞培养液为含8% NBS的MEM,病毒培养液为含2%NBS的MEM

1.1.3  实验动物    大耳白兔,购自武汉生物制品研究所。

1. 2 方法

1.2.1 猪瘟病毒感染ST细胞    -70保存的HCLV湿毒室温水浴使其解冻,备用。取密度为1.0×1053.0×105个细胞/ml的ST细胞悬液,接种到96孔细胞培养板,每孔100μl 375%CO2贴壁培养16h24h,待细胞长满单层,弃去细胞培养液,加入病毒培养液100μl,接种病毒培养液适当稀释的HCLV 100μl,继续培养72h96h,备用。

1.2.2 建立IFA检测方法

1.2.2.1操作步骤    弃掉1.2.196孔板内的病毒培养液,PBS洗细胞2次,80%冷丙酮固定细胞培养板10min20minPBS洗细胞2次,加入一抗(猪瘟单抗),37℃孵育1hPBS洗细胞4次,加入二抗(羊抗鼠IgG-FITC),37℃孵育1hPBS洗细胞4次,双蒸水洗细胞1次,倒置荧光显微镜观察。

1.2.2.2抗体稀释度优化    100倍、300倍、1000倍稀释的一抗用于IFA操作,按照1.2.2.1方法从上述三个稀释倍数中选出一抗的最适稀释度。二抗为常用商品化试剂无需优化使用浓度,即羊抗鼠IgG-FITC按说明书建议的100倍稀释使用。

1.2.3建立IPMA检测方法

1.2.3.1操作步骤    弃掉1.2.196孔板内的病毒培养液,PBS洗细胞2次,80%冷丙酮固定细胞培养板10min20minPBS洗细胞2次,加入一抗(猪瘟单抗),37℃孵育1hPBS洗细胞4次,加入二抗(HRP-SPA),37℃孵育1hPBS洗细胞4次,双蒸水洗细胞1次,加过氧化物酶底物,37℃孵育10min60min,弃去底物,双蒸水洗细胞1次,倒置显微镜观察。

1.2.3.2抗体稀释度优化    100倍、300倍、1000倍稀释的一抗用于IPMA操作,按照1.2.3.1方法从上述三个稀释倍数中选出一抗的最适稀释度。二抗为常用商品化试剂无需优化使用浓度,即HRP-SPA按说明书建议的8000倍稀释使用。

1.2.3.3 底物选择    按照1.2.3.1方法对使用的过氧化物酶底物种类进行优化,从AECDABTrueBlue中选择辨识度最高的显色底物。

1.2.4 IFA方法或IPMA方法测定细胞源猪瘟疫苗半成品和成品的病毒含量   -20保存的疫苗半成品室温水浴使其解冻;成品苗测定前以疫苗稀释液复溶至冻干前体积。使用96孔细胞培养板,选择10-110-6六个稀释度,每稀释度重复6孔,每孔加100μl,并设不接毒对照6孔。按1.2.11.2.21.2.3方法接毒和检测。观察到阳性信号的孔记为阳性,否则为阴性。Reech-Muench法计算并换算出样品的病毒含量(TCID50/ ml) 

1.2.5 细胞源猪瘟疫苗半成品和成品的RID测定    1.2.6中的半成品和成品疫苗以《中华人民共和国兽药典》上的方法测定RID[4],并与TCID50测定结果比较。每个样品测定20万倍、50万倍、100万倍、200万倍四个稀释度。

2  结果

2.1 IFA方法优化条件

倒置荧光显微镜下观察,100倍、300倍、1000倍稀释的一抗用于检测,阴性细胞无任何背景(图1A)。阳性细胞以100倍、300倍稀释的一抗检测,荧光信号明显(图1B);以1000倍稀释的一抗检测,荧光信号较弱(图1C),因此,一抗稀释倍数最高确定为30096孔病毒培养板以80%丙酮固定,经过一抗、二抗各1小时的孵育,可见光下观察,孔内细胞脱落少(图1D),可以很好的避免漏检。

 

B

 

D

 

C

 

A

 

     

 

A阴性孔100倍稀释一抗;B阳性孔300倍稀释一抗;C阳性孔1000倍稀释一抗,D 可见光下细胞状态

1 HCLV免疫荧光

2.2 IPMA方法优化条件

从图可以看出, 100倍稀释一抗后AECDABTrueBlue都有很好的显色效果(图2ABC),一抗二抗相同的情况下,Trueblue显示蓝色,与粉色AEC和棕色DAB比较更易辨识;1000倍稀释一抗后AECDAB显色孔中几乎无法辨识出阳性信号,TrueBlue显色孔仍可辨识(图2GHI);而300倍稀释一抗后TrueBlue显色,结果辨识度好,又不需要高浓度单抗(图2F )。综合以上结果,最终选用使用300倍稀释一抗,TrueBlue显色。96孔病毒培养板以80%丙酮固定,经过一抗、二抗各1小时的孵育,显色液10min60min孵育,孔内细胞脱落少(图2),可以很好的避免漏检。

 

   

A 一抗100倍稀释AEC显色;B 一抗100倍稀释DAB显色;C一抗100倍稀释TrueBlue显色;

D 一抗300倍稀释AEC显色;E 一抗300倍稀释DAB显色;F一抗300倍稀释 TrueBlue显色;

G一抗1000倍稀释AEC显色;H 一抗1000倍稀释DAB显色;I一抗1000倍稀释TrueBlue显色

2 IPMA不同一抗稀释倍数,不同底物显色结果

2.3 IFA方法和IPMA方法测定HCLV病毒含量

用确定的IFA方法测定

HCLV病毒含量。本次操作,可观察到阳性信号的最高稀释度孔为10-4稀释度,阳性信号强烈(图3A)。少量甚至单个细胞胞浆显示的荧光信号也清晰可见(图3A箭头所指)。

用确定的IPMA方法测定HCLV病毒含量。本次操作,可观察到阳性信号的最高稀释度孔为10-4稀释度,阳性信号强烈,少量甚至单个细胞胞浆蓝色着染也清晰可见(图3B箭头所指)。

 

B

 

A

 

 

A IFAB IPMA

3 IFAIPMA可检测到阳性信号的最高病毒稀释度

 

2.4 IFAIPMA法与兔热法测定猪瘟兔化弱毒病毒含量比较

以疫苗稀释液复溶的猪瘟成品疫苗,存在冻干保护剂,操作IFAIPMA前观察,10-1稀释度孔细胞状态略差于对照孔细胞,IFAIPMA操作后,细胞脱落20%80%。操作IFAIPMA前后,10-2稀释度孔细胞状态与对照孔细胞无差异。

同一样品IFA方法、IPMA方法各三次重复测定,结果无显著差异。说明IFA方法、IPMA方法测定结果重复性较好。测定的病毒含量TCID50数值与兔体反应热方法测定的RID数值,差异较大,但有一定的平行关系。RID结果数值高于TCID50结果数值1个滴度左右。详细结果见表1

1 IFA方法、IPMA方法及兔体反应热方法测定病毒含量比较

被检样品

IFA(TCID50/ml)

IPMA(TCID50/ml)

RID(RID/ml )

半成品1

105.3±0.26105.0105.5*

105.25±0.25105.0105.5*

2×106

半成品2

105.4±0.14105.25105.5*

105.33±0.14105.25105.5*

2×106

成品1

104.4±0.13104.25104.5*

104.3±0.26104.0104.5*

0.5×106

成品2

/

104.5

1×106

成品3

/

104.33

0.5×106

成品4

/

104.0

0.2×106

成品5

/

103.67

0.5×106

*为三次重复测定,平均数±标准差,括号中的数值为数据范围

3 讨论

前人将IFAIPMA两种免疫学方法分别应用到CSFV检测中,解决了CSFVCPE、无法直接判定细胞是否感染的难题。以此为基础,还开发了结合IFAIPMA的猪瘟病毒TCID50测定方法,方法的具体操作步骤和应用见于很多报道[1-3,5]。笔者使用商品化猪瘟单抗、优化的检测条件,对猪瘟疫苗病毒含量进行测定,以期作为RIDPD50的补充方法加强猪瘟疫苗的质控。现就HCLV IFAIPMA方法的优化和应用做如下分析。

本研究筛选的IPMA底物显示蓝色有很好的辨识度,同一样品IPMA方法和IFA方法测定的TCID50结果也相近,加之IPMA操作无需昂贵的荧光显微镜,所以IPMA测定方法非常适合应用到HCLV定量中。

 将优化的IFAIPMA方法用于测定某批次(细胞源)猪瘟疫苗成品、半成品的疫苗效价。猪瘟疫苗半成品为含有猪瘟病毒的细胞培养液,在检测前无需特殊处理。猪瘟成品疫苗是半成品中加入冻干保护剂冻干后的制品,测定前以疫苗稀释液复溶至冻干前体积。10-1稀释的猪瘟成品疫苗由于保护剂浓度高,使得细胞状态略差于对照孔细胞。10-2稀释的猪瘟成品疫苗,虽然存在少量冻干保护剂,但不对细胞状态造成影响。

《中华人民共和国兽药典》将RIDPD50作为评定猪瘟疫苗效力的方法[4]。实际操作中受实验动物质量的影响,有时检测结果不能够完全反应疫苗效价。而IFAIPMA方法简单,受外界因素影响小,结果稳定。方法可以应用到猪瘟疫苗半成品和成品检验中作为RIDPD50的辅助方法控制疫苗质量。从本研究的少量数据分析,IFAIPMA方法与兔热法测定的病毒含量存在差异,兔热法测定数值更高。但是不同方法测定结果(RIDPD50TCID50)的对应关系在文献中有不同于本研究的结果,各研究结果也存在差异 [1-3,6],可能是RIDPD50测定时实验动物个体差异、IFAIPMA测定时细胞状态不同或检测用抗体敏感度不同引起。现有文献中不同方法测定结果之间的平行关系数据相对较少,还不足以得出准确结论,有必要深入系统研究,以期选出一种简单准确的方法用于猪瘟疫苗效价。