七星彩

             技术服务
手机:18140203169
地址:成都市锦江区静安路1号98-1-116号

详细内容 你的位置: 首页 > 技术服务 > 技术服务  

猪圆环病毒2型cap蛋白ELISA检测方法的建立及初步应用


来源:       发布时间:2014/9/1 0:00:00     点击率:50

猪圆环病毒2cap蛋白ELISA检测方法的建立及初步应用

廖园园,谢红玲

(武汉中博生物股份有限公司,武汉 430070

摘要:将杆状病毒表达系统表达并经梯度离心纯化的PCV2 Cap蛋白作为标准品,利用双抗夹心法建立了针对猪圆环病毒2型抗原的检测方法,并应用于圆环病毒2型基因工程疫苗的质控。结果表明,多抗最适包被浓度为1µg/ml,最佳封闭液为1%BSA,最佳单抗反应浓度为2µg/ml,反应时间60min,最佳二抗使用稀释度为1:40000,反应时间为60min,最佳抗原反应时间为60min。该方法与Sf9细胞、BSA和其它猪病病毒抗原之间无交叉反应,最低检测抗原量为5ng

关键词:猪圆环病毒2型,衣壳蛋白CapELISA,抗原检测,夹心法

猪圆环病毒2(Porcine circovirus type 2PCV2)是引发断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaningmultisystemic wasting syndromePMWS)的主要病原,该病主要以患畜生长缓慢、进行性消瘦和多系统病理损伤为特征。除了引发PMWS外,PCV2还与猪皮炎肾炎综合征(PDNS)、猪增生性坏死性肺炎(PNP)、仔猪先天性震颤(CT)、母猪繁殖障碍等疾病相关。Cap蛋白是该病毒的主要结构蛋白,含有4个抗原表位,具有较好的免疫原性和抗原性,是检测该病毒特异性抗体的理想靶抗原表位,也是现在基因工程疫苗研究的热点蛋白。为建立一种敏感、特异、快速的猪圆环病毒2型抗原检测方法,使PCV2基因工程苗的质控更快更准更方便,本研究利用双抗体夹心法建立了一种检测PCV2 Cap蛋白的方法,并初步应用于猪圆环病毒2型亚单位基因工程疫苗的质量检测。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1主要试剂和仪器  PRV细胞毒样品,PPV样品,PRRSV样品,CSFV样品和PCV1样品由本实验室保存;HRP标记的羊抗小鼠IgG二抗、HRP标记的羊抗兔IgG二抗及TMB购自Sigma公司;牛血清白蛋白(BSA)购自Ameresco公司;BCA蛋白定量试剂盒购自GE公司;酶标板购自深圳金灿华公司;其他化学试剂主要来自国药七星彩化学试剂公司分析纯。其他主要设备有:包被机,洗板机,酶标仪,恒温孵育箱。

1.1.2 PCV2 Cap蛋白的制备  提取猪圆环病毒2型(PCV2)基因组,通过设计特异性引物扩增ORF2基因片段,利用Bac-to-Bac系统构建能表达PCV2-ORF2基因(Cap蛋白)的重组杆状病毒,将该重组杆状病毒感染Sf9细胞,收获表达的Cap蛋白,通过CsCl密度梯度离心纯化后作为检测的抗原标准品。

1.1.3 PCV2多抗和单抗的制备

PCV2 Cap蛋白常规免疫健康家兔,待兔血清中PCV2抗体用ELISA方法(生产公司和产品索取号应在试剂中列出)[LYY1] 检测效价达1:1 000以上,即可采血分离血清。分离的血清通过辛酸-硫酸铵沉淀法进行纯化获得所需抗PCV2抗原纯化多抗。

应用杂交瘤技术制备单抗,PCV2 Cap蛋白常规免疫BALB/c小鼠,得到抗原刺激的脾脏细胞,将脾脏细胞和小鼠的骨髓瘤细胞系进行融合,利用HAT选择性培养基筛选杂交瘤细胞,用ELISA方法和IFA(间接免疫荧光)方法鉴定抗PCV2的杂交瘤细胞株,进行三次亚克隆化后得到分泌高特异性的单克隆抗体的细胞株,通过小鼠腹水生产抗PCV2的单克隆抗体,通过辛酸-硫酸铵沉淀法将腹水进行纯化,获得的既为所需抗PCV2单克隆抗体。

1.2 ELISA方法的建立

1.2.1 最佳抗体包被浓度、单抗使用浓度和二抗使用浓度的确立

按照方阵滴定方法优化ELISA反应条件。以pH9.6碳酸盐缓冲液将纯化的抗PCV2-Cap多抗稀释至终浓度为0.5,1,2,4µg/ml100µl/孔包板,4过夜。PBST洗板后,加1%BSA封闭2h。抗原标准品用PBS稀释,浓度为3.2,1.6,0.8,0.4,0.2,0.1,0.05,0µg/ml100µl/孔,同时设阴性对照,371hPBST洗板后,分别加入终浓度为1,2,4µg/ml的抗PCV2-Cap单抗,100µl/孔,371hPBST洗板后,分别加入1:200001:400001:80000稀释的二抗,100µl/孔,371hPBST洗板后加入TMB底物溶液,100 µl/孔,37 10min。加入1mol/L的H2SO4 5Oµl/孔,终止反应,于酶标仪450 nm读数,每个稀释度重复一次,取其平均值。应用软件CurveExper进行结果分析。

1.2.2 封闭液的确定

以最佳多抗浓度包被酶标板,洗涤,分别用含0.5BSA1BSA1.5BSA2BSA5%脱脂乳、2%明胶及1 BSA+0.5%酪蛋白的PBST 200µl/孔,37 封闭2 h,抗原标准品按1.2.1方法稀释,进行ELISA测定,其他步骤同1.2.1。比较各组阴、阳性样品的OD值和PN值,以选择合适的封闭液。

1.2.3 封闭时间的选择

以最佳多抗浓度包被酶标板,洗涤,用确定的封闭液200µl/孔,分成3组,分别为37 封闭1h372 h373 h 424 h。封闭后,抗原标准品按1.2.1方法稀释,进行ELISA测定,其他步骤同1.2.1。比较各组阴、阳性样品的OD值和PN值,以选择合适的封闭时间。

1.2.4 单抗反应时间的确定

    酶标板按照确定的条件包被和封闭后,抗原标准品按1.2.1方法稀释,进行ELISA测定,单抗反应时间分别为30min45min60min75min,其他步骤同1.2.1。比较各组阴、阳性样品的OD值和PN值,以选择最佳单抗反应时间。

1.2.5 酶标二抗反应时间的确定

    酶标板按照确定的条件包被和封闭后,抗原标准品按1.2.1方法稀释,进行ELISA测定,酶标二抗反应时间分别为30min45min60min75min,其他步骤同1.2.4。比较各组阴、阳性样品的OD值和PN,以选择最佳酶标二抗反应时间。

1.2.6 特异性试验

分别取Sf9阴性细胞裂解样品,BSAPRV细胞毒样品,PPV样品,PRRSV样品,CSFV样品,PCV1样品,PCV2基因工程苗样品,1:101:100稀释后进行ELISA测定。同时设立标准品和阴性对照。

1.2.7 重复性试验

    3个不同批次的试剂盒分别检测PCV2基因工程苗样品和阴性细胞样品,每份样品重复检测4次,计算批内及批间变异系数(C.V)。

1.2.8 比较试验

    分别应用本方法和蛋白电泳及bandscan软件进行蛋白含量分析两种方法对PCV2基因工程疫苗进行检测,比较结果。

2 结果

2.1 最佳抗体包被浓度、单抗使用浓度和二抗使用浓度的确立

方阵试验如表1所示,相关系数(γ)值越高标准误(S)值越低的组别,包被条件和单抗及二抗浓度的条件越佳。确定多抗最佳包被浓度为1µg/ml,单抗最佳浓度为2µg/ml,二抗最佳稀释度为1:40000

1    PCV2-Cap ELISA方阵滴定实验结果分析

 

 

多抗浓度(µg/ml)

二抗稀释度

单抗浓度(µg/ml)

0.5

1

2

4

γ

S

γ

S

γ

S

γ

S

1:20000

1

0.9456

0.321

0.99866

0.2409

0.99634

0.245

0.9778

0.215

2

0.9870

0.196

0.99974

0.1255

0.99789

0.067

0.9985

0.135

4

0.9942

0.124

0.99820

0.0721

0.99945

0.134

0.9934

0.179

1:40000

1

0.9870

0.220

0.99963

0.4401

0.99800

0.340

0.9871

0.231

2

0.9982

0.096

0.99994

0.0175

0.99959

0.046

0.9992

0.035

4

0.9963

0.120

0.99910

0.0530

0.99960

0.120

0.9981

0.182

1:80000

1

0.9934

0.078

0.99912

0.0661

0.99923

0.129

0.9934

0.238

2

0.9978

0.124

0.99271

0.1021

0.99566

0.209

0.9988

0.103

4

0.9770

0.178

0.99882

0.0987

0.99547

0.088

0.9919

0.245

2.2 封闭液的确定

结果见表21%BSA的PN值最高,封闭效果最好。

2    封闭液的确定

封闭液

阳性样品P/N

阴性对照OD

1

2

3

4

5

6

0.5BSA

5.38

7.06

8.09

9.13

9.78

10.21

0.102

1BSA

7.30

9.46

11.91

13.14

14.48

15.46

0.063

1.5BSA

7.25

9.14

11.01

12.78

13.66

15.02

0.059

2BSA

7.16

9.07

11.26

12.37

13.10

14.76

0.062

1BSA +0.5%酪蛋白

7.1

8.91

11.2

12.89

13.21

14.55

0.061

2%明胶

5.12

6.92

7.9

8.67

9.15

10.09

0.087

5%脱脂乳

6.99

8.79

10.88

12.98

13.09

13.93

0.073

2.3 最佳封闭时间的确定

结果见表3,用1%BSA封闭2h的效果最好。

3    封闭时间的确定

封闭时间

阳性样品P/N

阴性对照OD

1

2

3

4

5

6

371h

5.09

6.21

8.09

9.22

10.98

11.14

0.078

372h

7.41

9.42

11.86

13.12

14.44

15.32

0.056

373h

7.30

9.12

11.50

12.99

13.12

14.71

0.062

424h

6.23

8.44

10.12

12.23

13.02

13.87

0.061

2.4 最佳单抗反应时间的确定

结果见表4,当反应时间为60min的时候,效果最佳,P/N值最高。

4    单抗反应时间的确定

单抗反应时间

阳性样品P/N

阴性对照OD

1

2

3

4

5

6

30min

6.11

6.96

7.82

8.89

10.23

11.34

0.058

45min

6.88

7.95

9.56

11.56

12.89

13.09

0.061

60min

7.33

9.24

11.56

13.09

14.82

15.54

0.055

75min

4.06

5.13

6.34

7.27

9.23

10.02

0.102

2.5 最佳二抗反应时间的确定

结果见表5,当二抗反应时间为60min的时候,效果最好。

5  二抗反应时间的确定

二抗反应时间

阳性样品P/N

阴性对照OD

1

2

3

4

5

6

30min

6.23

6.78

7.92

8.99

10.76

11.78

0.052

45min

6.77

7.99

9.88

11.62

12.56

13.89

0.065

60min

7.39

9.44

11.28

13.43

14.77

15.87

0.067

75min

4.34

5.89

6.78

7.69

9.45

9.89

0.134

2.6特异性试验

    用该方法分别检测Sf9阴性细胞裂解样品,BSAPRV细胞毒样品,PPV样品,PRRSV样品,CSFV样品和PCV1样品,结果均为阴性;检测PCV基因工程苗样品为阳性,最低检测量可达5ng。标明该方法具有很好的特异性和灵敏度。

2.7 重复性试验    该方法制备的3批试剂盒检测PCV2基因工程苗样品和阴性细胞样品(特异性实验中没有阴性细胞样品的检测)[LYY2] 的结果为,批内变异系数2%~4%,批间变异系数3%~6%,均小于10%,表明该方法有较好的重复性。

2.8 比较试验

    通过对三批PCV2基因工程疫苗样品检测发现:双抗体夹心法检测结果分别为60µg/ml87µg/ml102µg/ml。对应蛋白电泳及bandscan软件分析的Cap蛋白含量分别为66µg/ml 92µg/ml110µg/ml,实验结果表明这两种方法检测结果差异不大。

3 讨论

目前,国内外采用的PCV2检测技术主要有:病毒分离培养,间接免疫荧光,免疫酶单层实验(IMPA),原位杂交(ISH),聚合酶链式反应(PCR)等等。其中PCR荧光定量检测方法灵敏度高,是现在实验室检测PCV2病毒的首选方法。但是此方法使用的仪器昂贵,对操作人员要求较高,不适合推广普及到基层单位和猪场。本研究利用双抗体夹心发建立了一种检测PCV2 Cap蛋白的方法,并初步应用于猪圆环病毒2型亚单位基因工程疫苗的质量检测,使用效果好。

本方法建立的关键是标准品的制备,PCV基因组由一条共价闭合环状单股DNA构成,包含两个大的开放阅读框架ORF1ORF2,分别编码病毒蛋白复制酶(Rep)和病毒衣壳蛋白(Cap)Cap蛋白是病毒的主要结构蛋白,是检测该病毒特异性抗体的理想靶抗原。由于该病毒在体外培养不产生细胞病变,病毒繁殖能力低,难于获得高产量的病毒抗原用于诊断目的。本方法中的Cap蛋白来源于昆虫杆状病毒表达系统,本系统表达外源蛋白产量高、免疫活性好、产物易纯化、反应背景低,在多种动物疫病诊断中得到应用。另外,我们还建立了检测PCV2衣壳蛋白抗体水平的方法,用以反映PCV2的抗体水平,对猪群PCV2抗体水平进行监测,以确切了解猪体免疫水平或感染状况,这两种方法的建立,为有效预防和控制PCV2的侵袭和传播,避免因该病发生而引起的重大经济损失。

本研究初步建立了一种PCV2-Cap抗原检测方法,后续工作还需要完成试剂盒的组装以及试剂盒敏感性、特异性和稳定性的研究并加强试剂盒的优化。


 [LYY1]用的间接ELISA法检测,二抗试剂在1.1.1中已经补充。

 [LYY2]就是2.6中的sf9细胞。