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猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒的研制及初步应用


来源:       发布时间:2014/9/1 0:00:00     点击率:210

猪圆环病毒2ELISA抗体检测试剂盒的研制及初步应用

廖园园,谢红玲

(武汉中博生物股份有限公司,武汉 430070

[摘要] PCV2 Cap蛋白单克隆抗体预包被酶标板,将杆状病毒表达系统表达的PCV2 Cap蛋白作为检测用抗原,利用捕获包被法建立了间接ELISA法用于猪圆环病毒2型抗体的检测。通过优化ELISA条件,研制试剂盒并应用于圆环病毒2型疫苗的免疫效果检验。利用研制的试剂盒与IFA、商品化进口和国产同类试剂盒对178份猪血清进行平行检测,总符合率分别为96.63%97.75%84.27%,与其他几种常见猪病毒抗体阳性血清无交叉反应。试剂盒批内、批间变异系数分别为2.35%4.06%4.87%6.54%28℃保存15个月稳定。基于用单抗预包被后再包被检测抗原,本试剂盒检测样品抗体的灵敏度和稳定性得以显著提高,因此适合于对不同来源猪圆环病毒2型疫苗人工免疫猪血清抗体进行检测,从而对猪圆环病毒2型疫苗的免疫效果进行评价。

[关键词] 猪圆环病毒2型;酶联免疫吸附试验;捕获包被;抗体检测

猪圆环病毒(PCV)是迄今发现最小的动物病毒。现已知PCV2个血清型,即PCV1 PCV2PCV1为非致病性的病毒,PCV2为致病性的病毒,是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS) 的主要病原。除了引发PMWS外,PCV2还与猪皮炎肾炎综合征(PDNS)、猪增生性坏死性肺炎(PNP)、仔猪先天性震颤(CT)、母猪繁殖障碍等疾病相关,是全球公认的危害养猪业的重要疫病。Cap蛋白是该病毒的主要结构蛋白,含有4个抗原表位,具有较好的免疫原性和抗原性,是检测该病毒特异性抗体的理想靶抗原表位。为建立一种敏感、特异、快速的猪圆环病毒2型抗体检测方法,使PCV2疫苗的效果评价更快捷、准确和方便,本研究利用捕获包被和间接ELISA法研制了一种检测PCV2抗体的试剂盒,并初步应用于猪圆环病毒2型疫苗免疫效果评价。

1  材料和方法

1.1  材料

1.1.1  主要试剂和仪器  PCV2病毒由本实验室保存;PCV2阳性质控猪血清及阴性质控猪血清、PCV1阳性猪血清、PRRSV阳性猪血清、CSFV阳性猪血清、PPV阳性猪血清、PRV阳性猪血清由本实验室制备;178份猪血清样本采自湖北博牧猪场;猪圆环病毒抗体检测试剂盒(进口),货号107SD310;猪圆环病毒2-dCap-ELISA抗体检测试剂盒(国产),批号111003PCV2猪多抗由美国VMRD公司提供;羊抗猪荧光二抗由Thermo公司提供;HRP标记的小鼠抗猪IgG二抗由洛阳赛尔维实验器材有限公司提供;HRP标记的羊抗小鼠IgG二抗及TMBSigma公司提供;牛血清白蛋白(BSA),Ameresco公司;BCA蛋白定量试剂盒,GE公司;酶标板,深圳金灿华公司;其他化学试剂主要来自国药七星彩化学试剂公司(分析纯)。其他主要设备有包被机、洗板机、酶标仪、恒温孵育箱、荧光显微镜。

1.1.2  PCV2 Cap蛋白的制备  利用杆状病毒表达系统进行Cap蛋白表达,将纯化后的蛋白经BCA蛋白定量试剂盒定量后作为检测用抗原。

1.1.3  PCV2单抗的制备  应用杂交瘤技术制备分泌PCV2单抗的细胞株,利用小鼠腹水生产抗PCV2的单克隆抗体,纯化后的单抗经BCA蛋白定量试剂盒定量后作为包被用抗体。

1.2  ELISA试剂盒的研制

1.2.1  反应条件的确定  按照方阵滴定方法优化ELISA反应条件,确定PCV2单克隆抗体和抗原的包被浓度。对一抗及二抗的最佳稀释度和反应时间进行优化。

1.2.2  判定标准的确定  取经IFA检测抗体阴性和PCR检测血清抗原阴性的猪血清40份,进行ELISA检测,统计平均OD450nm值和标准差,计算阴阳性值的临界点。

1.2.3  敏感性、特异性和比较试验  取经IFA检测抗体阳性的PCV2猪阳性质控血清10份、取经IFA检测抗体阴性和PCR检测血清抗原阴性的阴性质控血清10份和PCV1阳性猪血清、PRRSV阳性猪血清、CSFV阳性猪血清、PPV阳性猪血清、PRV阳性猪血清各1份,共25份血清用本研究试剂盒进行ELISA检测,分析试剂盒敏感性和特异性。取178份猪血清样本用本研究试剂盒和IFA方法及商品化进口和国产两种试剂盒分别进行检测,分析符合率。

1.2.4  试剂盒组装、重复性及保存期试验  试剂盒由96孔抗原包被板、阳性和阴性对照血清、小鼠抗猪IgG酶标二抗、显色液AB及、终止液和10倍浓缩洗涤液组成。取3个不同批次的试剂盒,每批5个,分别检测PCV2阳性猪血清和阴性猪血清,计算批内及批间变异系数(CV)。将试剂盒置2~8 保存,不同时间取样检测保存期。

1.2.5  人工免疫血清检测  选取21日龄非免疫健康易感仔猪30头,PCR检测血清PCV2病毒阴性,ELISA检测血清抗体效价低于1:50。用本实验室研究的基因工程疫苗及全病毒灭活疫苗及三种商品化疫苗(进口PCV2基因工程疫苗和国产全病毒灭活疫苗1及国产全病毒灭活疫苗2)进行常规免疫,每种疫苗免疫5头,留5头做空白对照,免疫后28 d采血进行ELISA检测。

2  结 果

2.1  ELISA反应条件的确立  确定单抗最佳包被浓度为2 µg/mL,每孔100 µL4 孵育过夜,封闭液1% BSA,每孔200 µL37 封闭2 h后包被抗原,抗原最佳包被浓度为3 µg/mL,每孔100 µL4 孵育过夜,一抗1:100稀释,每孔100 µL37 反应45 min,二抗最佳稀释度为1:2000,每孔100 µL37 反应45 min,显色液AB每孔各50 µL,显色10 min2 mol/L硫酸溶液终止,酶标仪450 nm读数。

2.2  判定标准的确定  使用本试剂盒检测经IFA检测抗体阴性和PCR检测血清抗原阴性的健康猪血清40份,求其平均OD450nm=0.181;标准差=0.068;按临界值=阴性样品平均值+3×标准差计算,其临界值为0.385。所以待检血清OD450nm值应≥0.4判为阳性,待检血清OD450nm值<0.385判为阴性。在0.385OD450nm0.4范围内,为可疑,需进行第二次检测,如还在此区间判为阴性。

2.3  敏感性、特异性和比较试验结果  10份阳性质控血清的IFA检测结果见图1和表110份阳性质控血清ELISA检测结果均为阳性,敏感性100%,阳性质控血清ELISA检测最高稀释倍数(ELISA效价)可达1:320010份阴性质控血清和5份其他猪病毒抗体阳性血清(PCV1PRRSVCSFVPRVPPV)的ELISA检测结果均为阴性,特异性100%178份猪血清样本的检测结果显示,本研究试剂盒和IFA方法及商品化进口和国产两种试剂盒的总符合率分别为96.63%(172/178)97.75% (174/178)84.27% (150/178)[U1] 

 

 

 

              a                                              b

1  猪血清IFA检测结果

a:阳性血清检测结果;b:阴性对照)

1  阳性质控血清ELISA检测结果

检测项目

血清编号

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

IFA效价

1:80

1:80

1:80

1:40

1:40

1:20

1:10

1:20

1:10

1:10

ELISA结果(OD450nm

2.129

2.018

2.183

1.943

1.672

1.732

1.289

1.498

0.683

0.732

ELISA效价

1:1600

1:3200

1:1600

1:1600

1:800

1:800

1:200

1:400

1:100

1:100

[MSOffice2] 2.4  重复性和保存期试验结果  3个不同批次的试剂盒,每批5个,分别检测PCV2阳性猪血清和阴性猪血清,批内变异系数为2.35%~4.06%,批间变异系数为4.87%~6.54%。保存期试验结果表明,2~8 保存15个月稳定。

2.5  人工免疫血清检测结果  人工免疫猪血清检测结果阳性率均在80%以上,具体结果见表2。两种国产全病毒灭活疫苗组分别各有一头免疫猪抗体呈阴性,分析原因可能与猪个体差异有关系,各猪产生抗体的时间和抗体水平不尽一致,也可能与疫苗质量有关系。

2  人工免疫猪血清检测结果

组别

28 d血清抗体检测结果(OD450nm

基因工程疫苗

2.178

1.389

1.934

1.032

1.692

全病毒疫苗

1.793

1.659

1.319

0.994

0.967

进口PCV2基因工程疫苗

0.413

1.256

0.758

1.404

0.645

国产全病毒灭活疫苗1

1.085

0.353

0.557

1.043

0.481

国产全病毒灭活疫苗2

0.631

0.582

0.929

0.711

0.329

空白组

0.062

0.075

0.092

0.103

0.068

3  讨 论

PCV2抗体检测对于进行PCV2流行病学调查、疫苗效果评价及试验用阴性猪的筛选等具有重要意义。目前,PCV2抗体检测的常用方法有病毒中和试验(SN)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接免疫荧光试验(IFA)和免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)SNIFAIPMA试验均需要结合细胞及病毒培养来进行检测,费时费力,对操作人员要求高,不适合推广和普及。本研究利用单抗捕获包被法建立了一种检测PCV2 抗体的方法,并组装形成试剂盒。研究结果表明,试剂盒灵敏度和特异性良好,可重复性强,2~8 保存15个月稳定。

本试剂盒研制的关键是利用PCV2单克隆抗体捕获PCV2 Cap蛋白进行包被板的制备,利用单克隆抗体的高特异性来进一步提高抗原包被板的抗原纯度和检测的敏感性及特异性。Cap蛋白是PCV2病毒的主要结构蛋白,是检测该病毒特异性抗体的理想靶抗原。市场上国产同类ELISA试剂盒主要有浙江大学研制、瑞普( 保定) 生物药业有限公司生产的猪圆环病毒2-dCap-ELISA抗体检测试剂盒,该试剂盒中所采用的抗原是原核系统表达的蛋白。本试剂盒中的Cap蛋白来源于昆虫杆状病毒表达系统,本系统表达外源蛋白产量高、表达的Cap蛋白能独立地形成病毒样颗粒,保持天然病毒空间构象结构、免疫活性好、且产物易纯化、反应背景低,已在多种动物疫病诊断中得到应用。比较试验结果表明,本试剂盒与IFA试验和商品化进口试剂盒的总符合率分别为96.63%97.75%,适合猪场血清抗体检测,对PCV2流行病学调查有重要意义;不同来源疫苗人工免疫血清检测结果表明本试剂盒适合市场上基因工程疫苗和全病毒灭活苗的免疫猪血清抗体的检测,可用于疫苗效果评价和猪群免疫抗体水平的监测。


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