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猪圆环病毒病及其生物制品学的研究进展


来源:       发布时间:2013/1/10 0:00:00     点击率:58

猪圆环病毒病及其生物制品学的研究进展

郎洪武

(中国兽医药品监察所,北京 100000

摘要:结合国内外对猪圆环病毒病的研究成果,概述了猪圆环病毒病的主要临床类型及其流行病学特点,并对其病原学、免疫学及生物制品学方面的研究进展进行了综合论述,为认识该病并有效防控该病提供参考。认为,猪圆环病毒2型的危害主要体现在断奶仔猪多系统衰竭综合征症状中,并与猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体等的继发感染有关。

关键词:猪圆环病毒病;临床类型;病原学;免疫学;生物制品

 

20世纪90年代初,世界上许多国家在病猪及一些无明显临床症状的猪体内检测到了一种新型猪圆环病毒。该病毒与已知的由PK-15细胞系分离的猪圆环病毒不同。根据对猪的致病性,人们将新出现的与临床疾病相关的猪圆环病毒命名为猪圆环病毒2型(PCV2),无临床致病性的猪圆环病毒命名为猪圆环病毒1型(PCV1)。PCV2感染后会出现断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)、猪呼吸系统混合疾病(PRDC)、猪繁殖障碍症、肉芽肿性肠炎、急性肺水肿(APE)、增生性坏死性肺炎(PNP)等。由此,猪圆环病毒病的含义指一系列综合症候群或是与PCV2感染相关的疾病。亦有报道称,这些综合征是由多种因素导致的,其中肯定包括PCV2,而且PCV2是主要病原。现已证实,PCV2主要侵害猪体的免疫系统,导致免疫抑制及集体抵抗力降低,干扰和破坏猪对其他疫病免疫抗体的产生和维持,从而继发其他疾病。因此,PCV2的危害性不能孤立而言,主要表现在它与其他重要疾病病原【如猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体、猪链球菌、多杀性巴氏杆菌等】的继发感染。猪圆环病毒病的发病率可达50%,死亡率可能因猪场条件、继发感染情况而不同,一般在5%70%。猪圆环病毒病中,以PMWS对养猪业造成的危害最为严重,在欧洲,该病每年可造成养猪业约6亿欧元的损失。

1 猪圆环病毒病的主要临床类型及流行病学特点

1.1 断奶仔猪多系统衰竭综合征

PMWS是由PCV2引起的以断奶仔猪呼吸急促或困难、腹泻、贫血、明显的淋巴组织病变和进行性消瘦为主要特征的疾病。该病主要侵袭哺乳期和保育期仔猪,尤其是618周龄仔猪最易感,其次24月龄猪发病率也比较高,发病率一般在10%20%(有时可达50%60%),死亡率4%20%,该病严重影响猪的生长发育,耐过后多变为僵猪,造成巨大的经济损失。本病最早见于1991年的加拿大北部地区,1997年分离到PCV2,随后美国、法国、英国、德国、意大利、西班牙、新西兰、丹麦、加拿大等国家先后报道发生该病。我国最早于1999年通过血清学方法证实存在该病感染。郎洪武等对北京、河北、山东、天津、江西、吉林、河南7省(市)的22个猪群559头各类猪群进行了检测,发现PCV2抗体阳性率可达42.9%,随后郎洪武等又从北京、河北的猪群中首次在国内分离鉴定了PCV2病原。随着我国各地对该病流行病学调查的深入,发现该病在我国各地的猪群中存在较高的感染率,给我国养猪业造成了相当大的经济损失。

PMWS表现的消瘦、生长迟缓、呼吸困难等临床症状提示了该病的免疫病理学特征。早期的病理变化主要表现为淋巴结肿大,T/B淋巴细胞减少,大量组织细胞及多核巨噬细胞浸润及细胞因子反应的交替或改变;胸腺常常发生皮质萎缩。组织细胞及树突状细胞内可看到胞内病毒包涵体。肺有时扩张,显微镜下可见间质性肺炎的病理变化,早期可见支气管周围纤维化及纤维素性支气管炎的病理变化;部分病例可见肝肿大,脾萎缩,显微镜下可见大面积细胞病变及炎症。一些病例中猪肾皮质表面会出现白点(非化脓性间质性肾炎),许多组织中可见局灶性淋巴组织细胞浸润。

1.2 猪皮炎肾病综合征

PDNS一般易侵袭仔猪、育成猪和成年猪。发病猪一般呈现食欲减退,精神不振,轻度发热或不呈现发热症状;喜卧,不愿走动,步态僵硬。最显著的症状为后肢及会阴区域皮肤出现不规则的红紫斑及丘疹,有时也会在其他部位出现红紫斑或丘疹。显微病理学观察显示,红斑及丘疹区域呈现与坏死性脉管炎相关的坏死及出血现象。全身特征性症状为坏死性脉管炎。该病发病率一般小于1%,也有高发病率的报道。大于3月龄的猪死亡率接近100%,年轻感染猪死亡率接近50%。严重感染的患病猪可在临床症状出现后几天内就死亡。

死于PDNS的猪病理变化一般为双侧肾肿大,皮质表面呈细颗粒状,皮质红色点状坏死,肾盂水肿。一般PDNS发病猪皮肤及肾都会呈现病理变化,但有时仅出现单一的皮炎或肾病的病变。有时淋巴结肿大或发红,脾出现梗死。显微镜下观察,PDNS猪淋巴结的病变与PMWS淋巴结病变相似。

1.3 其他主要相关疾病

猪呼吸系统混合疾病的病原除PCV2外,还有PRRSV、猪流感病毒、猪肺炎支原体、猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和猪链球菌等。其中,PCV2PRRSV和猪肺炎支原体是引起PRDC的主要病原。一般认为PCV2与其他病原混合感染会导致PRDC,但不代表PRDC的病原中一定会含有PCV2PRDC通常出现在46月龄的猪,临床症状包括持续高烧,咳嗽和呼吸困难,厌食,消瘦,精神沉郁,抗生素使用无效,病程中后期死亡率明显增加。一般发病率为30%70%,死亡率为4%6%PCV2感染还与猪后期流产及死胎疾病相关,即通常所指的繁殖障碍性疾病。然而,与PCV2有关的繁殖系统疾病的田间病例很少。这与成年猪PCV2的的血清阳性率较高有关。PCV2相关的繁殖系统疾病中,死胎或中途死亡的新生仔猪一般呈现慢性、被动性肝充血及心脏肥大,多个区域呈现心肌变色等病变。

1.4 猪圆环病毒病的流行病学

家猪和野猪是PCV2的自然宿主,猪科以外的其他动物对PCV2均不敏感。PCV2可经口腔、呼吸道途径感染不同日龄的猪,病猪所接触的物品或病猪的分泌物(血液、尿液、粪便或黏液)可能含有传染性病原体。怀孕母猪感染PCV2后,也可经胎盘垂直传染感染仔猪,并导致繁殖障碍。发生猪圆环病毒病,除PCV2的感染外,还和其他多种诱因有关,包括猪舍环境卫生、猪群密度、运输应激、猪体PCV2抗体水平、其他疫苗免疫、混合感染等。

研究发现,PCV2人工感染或自然感染马、牛、羊、兔后血清中不产生抗体,但在小鼠体内可以复制,并能在鼠间传播,因此小鼠被作为PCV2研究的重要动物模型。

2 病原学

PCV2属圆环病毒科圆环病毒属病毒。该科病毒是已知动物病毒中最小的。PCV2为无囊膜、单股环状双向DNA病毒,含17671768个核苷酸,分子质量为5.8×102。病毒粒子的直径平均为17nm,对酸性环境(pH3)、氯仿或高温(56℃和70℃)有抵抗能力。不凝集牛、羊、猪、鸡等多种动物和人的红细胞。病毒的DNA利用宿主细胞的酶自行复制。

PCV2可以在PK-15传代细胞上生长繁殖,但不产生CPE,感染的PK-15细胞内含有许多胞浆内包涵体。少数感染的细胞内含有核内包涵体。PCV2接种PK-1518h可检测到病毒RNA30h可检测到游离病毒粒子,但病毒效价普遍不高。有报道称经D-氨基葡萄糖处理接种过PCV2的细胞培养物,可大幅度的提高病毒的繁殖量。目前的研究认为,单核/巨噬细胞是PCV2的靶细胞,但复制效率不高,有学者在用PCV2接种猪肺泡巨噬细胞后利用细菌脂多糖处理,可诱导PCV2的复制。

2.1 猪圆环病毒的分型

猪圆环病毒分为2个血清型,PCV1PCV2。其中PCV1不引起临床症状,广泛存在于正常猪体各器官组织及猪源细胞。PCV2对各种年龄的家猪和野猪均有致病性。与血清型分类相对应,猪圆环病毒基因组也分为2种基因型,即PCV1型基因组和PCV2型基因组。PCV2型基因组全长为1766bp1767bp1768bp,通常含有11ORF,其中ORF1ORF5ORF7ORF10在病毒链上,而ORF2ORF3ORF4ORF6ORF8ORF9ORF11在互补链上,这些基因表现为重叠基因,从而充分利用了病毒有限的遗传物质。ORF1ORF22个主要的开放阅读框,分别编码与病毒复制有关的Rep´蛋白和病毒的衣壳蛋白(Cap)。在ORF1ORF2的中间区域是病毒DNA的复制起始区(Ori)茎环序列,在病毒的蛋白合成、DNA自身复制及子代病毒产生中发挥重要作用。对PCV2的基因组分析发现,所有PCV2分离株的基因组同源性都在90%以上,但与PCV1的核苷酸同源性却只有68%79%PCV1PCV2间与复制相关的DNA复制起始区和复制酶编码基因(rep)序列的同源性分别约为79.5%82%;但其衣壳蛋白编码基因(cap)存在较大差异,同源性只有约62%

对于PCV2的基因分型,很多学者都提出了各自不同的原则和方法。欧盟猪圆环病毒病委员会提出的将PCV2分为PCV2aPCV2bPCV2c三种基因亚型的分类方法被广泛接受,其分型的基因原则是全基因遗传距离大于0.02ORF2基因遗传距离大于0.035,其中PCV2aPCV2b是目前存在的主要基因型。基因型与致病力的关系壳耙渤晌PCV2研究的热点,Grau-Roma等发现PMWS发生的猪群中分离到的PCV2多属于PCV2b(原文中命名为genotype1),而从健康猪群和有轻微消瘦症状的猪分离到的PCV2多属于PCV2a(原文中命名为genotype2),结果提示PCV2存在不同毒力的毒株,且基因分型可能对判断疾病流行状况有很大帮助。而且系统进化分析显示,PCV2a型毒株在出现时间上早于PCV2b型毒株,许多国家也发现随着PMWS的不断暴发,出现了由PCV2aPCV2b基因型转换的现象。此外有人还发现在同一猪体内分离到多个PCV2分离株,且这些分离株分属不同的基因型,此现象提示基因重组可能在PCV2遗传进化中起到重要作用。按照欧盟猪圆环病毒病委员会的分类方法,我国目前的PCV2分离株多属于PCV2b亚型。但国内也有学者认为我国存在PCV2aPCV2bPCV2dPCV2e4个基因型。

3 免疫学

体外试验表明,在早期的免疫应答中,PCV2对树突状细胞(DC)和巨噬细胞具有偏嗜性,而且PCV2DC和巨噬细胞功能的影响可能会间接导致体内其他免疫细胞的功能紊乱或体内平衡的破坏,如淋巴细胞的减少、细胞因子分泌的抑制等。研究表明,这种影响主要取决于PCV2的DNA而非PCV2的结构蛋白。有报道单核细胞衍生的巨噬细胞和肺泡巨噬细胞更容易内化PCV2,有人则发现PCV2的感染会显著影响巨噬细胞的活性,尤其是杀微生物的活性,而且还增强了TNF-α和IL-8的分泌,以及肺泡巨噬细胞趋化因子Ⅱ(AM-CF-Ⅱ)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和单细胞趋化蛋白-1MCP-1mRNA水平的上调。感染PCV2的猪胸腺和扁桃体中的IL-10IFN-γmRNA的量有所增加,而淋巴细胞中IL-2IL-4IL-10IL-12IFN-γ的mRNA水平有所下降,但其IL-1β和IL-8的mRNA水平却上升,这表明PCV2可以导致T细胞免疫抑制。外周血单核细胞(PBMCs)体外研究结果显示,分离自PCV2感染猪PBMCs产生IFN-γ和IL-2的能力下降,尤其在其他抗原(如PRV)、有丝分裂原或超抗原共同刺激的条件下。Darwich等报道感染PCV2但有衰竭症状的猪IGM+CD8+CD4+/CD8+双阳性细胞(DP)数量减少,而未感染PCV2但有衰竭症状的猪CD8+细胞比例增加,提示PCV2的感染可能是造成淋巴细胞减少的原因。由于CD8+CD4+/CD8+双阳性细胞在PMWS病程发展中发挥了重要作用,其中CD8+细胞与细胞毒性免疫应答有关,而DP淋巴细胞具有免疫记忆及免疫效应的双重功能,它们的减少必将影响机体的免疫应答。

一些病毒(如PRVPRRSV)或其他非感染因子(如有丝分裂原或超蛋白)会提高PCV2感染猪体内PCV2的复制水平,使血清和组织中病毒的效价升高,从而提高了PCV2引发PMWS的概率。据报道,在一暴发PMWS的猪场,使用了痘类病毒免疫调节剂和猪支原体肺炎疫苗的猪比没有任何刺激的猪有更加严重的病理变化及更高的死亡率,其组织内的病毒效价也更高。将PCV2与匙孔血蓝蛋白和弗氏不完全佐剂混合注射仔猪,同时腹腔注射硫基乙酸培养基以刺激腹腔巨噬细胞,发现所有仔猪体内PCV2都大量增殖且出现PMWS症状。虽然关于这些协同刺激因子及免疫刺激启动PMWS的机制尚不清楚,但是感染猪淋巴组织病变、继发感染的发生及淋巴组织中免疫细胞亚群和外周血单核细胞的变化是PMWS严重感染猪的常见特征,表明发病猪机体处于免疫抑制状态。

在试验猪体内,血清转化一般发生在感染后的第1428天。另一些研究也证实血清转化发生在PCV2感染后期。但田间条件下,早期初乳抗体在哺乳期及保育期会逐渐下降,其后发生血清转化。这种血清转化一般发生于712周龄,抗体会一直持续到28周左右。由于PCV2母源抗体的影响,低于4周龄的猪一般不会发生PMWS。然而,也有研究认为高水平初乳PCV2抗体对仔猪PMWS并没有显著的保护作用。田间病例的研究结果显示,尽管23月龄时机体就已启动了体液免疫应答,但仍有部分生长猪或育成猪存在病毒血症,说明PCV2抗体并不能产生完全的保护,但感染猪未出现明显的临床症状,目前尚不能确定是猪圆环病毒引发的体液免疫在起作用还是猪自然抵抗力在起作用。

4 生物制品学研究进展

自该病在我国报道以来,其免疫学及生物制品学方面的研究和探索很快成为一个热点。我国开展的研究主要包括以下几方面。

杆状病毒载体疫苗的研制:2005年,刘长明等将猪圆环病毒2型的ORF2在昆虫杆状病毒中进行了表达,该重组蛋白具有良好的免疫活性反应。昆虫细胞系表达系统要取得最佳的结果,必须有优质的培养介质和条件,对氧的需求量很大,大规模生产中必须搅拌,但搅拌过程又可能对细胞造成很大的压力。该系统无法进行连续性表达;糖基化方式与哺乳动物细胞存在一定差异,糖侧链甘露糖的成分较高,而复合寡糖缺乏,且糖蛋白的糖链结构多为简单的不分支结构,此外宿主细胞生长慢,培养基昂贵。伪狂犬病毒载体疫苗的研制:琚春梅等对表达了猪圆环病毒2ORF2蛋白的重组为狂犬病病毒进行了生物学特性的研究,结果表明该重组病毒具有良好的遗传稳定性,能诱导小鼠产生特异性免疫应答,并对强毒的攻击具有一定的保护作用。

痘病毒载体疫苗的研制:金宁一等对PCV2核酸疫苗和痘病毒载体表达PCV2 ORF2的亚单位疫苗作了比较,发现痘病毒载体表达系统制备的亚单位疫苗比核酸疫苗抑制PCV2病毒复制的效果要好,在临床试验中能使猪抵抗PCV2的攻击。

腺病毒载体疫苗的研制:王先炜等构建了含有猪圆环病毒2Cap蛋白的重组腺病毒,为研制PCV2重组腺病毒基因工程疫苗进行了探索。

嵌合病毒的研制:刘新文等构建了具有感染性的嵌合猪圆环病毒PCV2-1,该重组病毒有望成为圆环病毒疫苗的候选株。

核酸疫苗的研制:金宁一等构建了猪圆环病毒2型核酸疫苗,该疫苗能诱导小鼠产生良好的细胞免疫和体液免疫。宋云峰等将PCV2 ORF2基因克隆入真核表达载体pCDNA3.1+),将构建的pCORF2作为核酸疫苗免疫小鼠。同时将具有蛋白转导功能的BVP22基因分别克隆到ORF2基因的上游和下游,使二者融合表达,并命名为pCORF2BVP22CBVP22ORF2。分4组免疫接种BALB/c小鼠,分别肌肉注射pCD2NA311(+)pCORF2pCORF2BVP22pCBVP22ORF2,共免疫2次。同时为在体外验证ORF2BVP22基因分别克隆入pEGFP2N1载体,构建了pNORF2pNBVP22,转染Hela细胞后在荧光显微镜下观察到了ORF2BVP22在体外的瞬时高效表达。结果显示,通过2次免疫后,各疫苗组均产生了针对ORF2的体液免疫抗体,同时证明BVP22可增强核酸疫苗的免疫效果,其中以BVP22ORF2上游的效果更好,为防控猪圆环病毒2型感染提供了较为理想的候选疫苗。

目前,一些国家已经研制出商品化的疫苗用于PMWS的防治,主要包括灭活疫苗、重组疫苗、DNA疫苗及嵌合病毒疫苗等。勃林格殷格翰动物保健(美国)有限公司利用昆虫杆状病毒表达ORF2蛋白,研究成功了PCV2亚单位疫苗,该疫苗的安全性及有效性都得到了试验肯定,并已在包括我国在内的多个国家注册。法国梅里亚公司利用PCV2接种悬浮培养的PK-15细胞繁殖病毒,将病毒抗原浓缩约1/40后,经β-丙酰内酯(BPL)灭活,制成油包水乳剂灭活疫苗,用于后备母猪或经产母猪免疫,仔猪通过吮吸初乳,获得被动保护,可减少PCV2引起的感染,并减少排毒、病理损伤和其他临床症状。该产品主要在欧洲一些国家注册使用。美国富道动物保健品公司利用猪圆环病毒1-2型嵌合体病毒感染PK-15细胞,病毒经浓缩后,经二乙烯亚胺灭活,制成灭活疫苗,该疫苗也在一些国家注册成功。

我国国内也已有自主研发的猪圆环病毒灭活疫苗(猪圆环病毒2型灭活疫苗SH株、猪圆环病毒2型灭活疫苗LG株和猪圆环病毒2型灭活疫苗DBN-SX07株)上市。猪圆环病毒2型灭活疫苗LG株由哈尔滨兽医研究所研制,该产品以猪圆环病毒2型遗传标记毒株LG株为毒种,经细胞培养传代,优化了病毒增殖条件,由获得较高效价的病毒培养物制备而成。该产品采用的ISA15VG佐剂属于水包油剂型,可刺激接种动物产生快速免疫应答反应,抗体效价高、持续时间长。猪圆环病毒2型灭活疫苗SH株是以南京农业大学为主要研发单位研究开发的,以PCV2分离株SH株接种PK15-B1克隆细胞制备抗原,浓缩后,经甲醛溶液灭活,与矿物油佐剂混合乳化制备而成。猪圆环病毒2型灭活疫苗DBN-SH07株是由北京大北农七星彩研究开发的,以PCV2分离株DBN-SH07株接种敏感细胞株PK-15A培养,收获细胞培养物,经β-丙酰内酯灭活后,与矿物油佐剂混合乳化制备而成。上述3种获准生产的疫苗均为常规灭活疫苗。

目前在研制中或已商品化的疫苗,大多是针对减少或改善仔猪PMWS症状的,商品化疫苗确切的使用效果也已被实验室试验和临床数据所证实。至于对皮炎肾病综合征、PCV2繁殖障碍及其他与PCV2有关疾病的预防效果,尚需进一步证实。